膠乳顆粒增強(qiáng)比濁法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA）是近年來(lái)出現(xiàn)的一種較為穩(wěn)定、準(zhǔn)確的體液蛋白均相免疫比濁檢測(cè)方法。相對(duì)于Elisa方法，省去了孵育和洗板的步驟，幾分鐘就能獲得結(jié)果；相對(duì)于金標(biāo)法具有更高的靈敏度，可用于定量檢測(cè)。

（1）操作簡(jiǎn)單，可在幾分鐘內(nèi)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)含量，真實(shí)反映病情進(jìn)展和評(píng)估治療效果，對(duì)于疾病的早期診斷和治療具有重要的臨床意義；
（2）不易受人為操作和外界因素干擾，檢測(cè)穩(wěn)定性和重復(fù)性都很好；
（3）能利用普通的生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，可在各級(jí)基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)普及和應(yīng)用。

因?yàn)榛钚院徒Y(jié)合動(dòng)力學(xué)是高度依賴于固定化分子的取向，故可用于偶聯(lián)和修飾的活性基團(tuán)必須慎重考慮。

生物分子可通過各種表面化學(xué)試劑偶聯(lián)到聚合物或硅基微球上?？捎玫谋砻婀倌軋F(tuán)包括：聚合-羧基和氨基（常用的）以及羥基、肼基和氯甲基；和硅-醇硅基、羧基。

交聯(lián)劑可用于活躍含水環(huán)境中表現(xiàn)出低反應(yīng)活性的基團(tuán)（碳二亞胺與羧基結(jié)合），或者加入到對(duì)彼此沒有反應(yīng)的基團(tuán)中（如氨基與氨基結(jié)合）

微球的特定組成將決定其特性，如如疏水性或親水性，正電荷或負(fù)電荷，表面電荷密度等，這些特點(diǎn)都會(huì)對(duì)其承載能力有一定影響。也就是說，生物分子怎么有效地進(jìn)入化學(xué)基團(tuán)附近，以便可能發(fā)生偶聯(lián)。他們還將影響非特異性結(jié)合特性，但非特異性結(jié)合可能與阻斷劑、緩沖液及檢測(cè)的條件（如：樣品稀釋）等有關(guān)。

試劑的質(zhì)量對(duì)成功的偶聯(lián)是至關(guān)重要的，并影響包被微球的性能。遵從制造商的指引

用于試劑調(diào)制，使用，存儲(chǔ)，和過期應(yīng)觀察到保證活性和穩(wěn)定性，并且采取措施防止污染。

確定不同試劑的適當(dāng)濃度，比如配體或交聯(lián)劑，對(duì)控制表面密度很重要。使用太少會(huì)導(dǎo)致包被不是較理想且活性低。使用太多會(huì)導(dǎo)致微球“過載”（空間位阻效應(yīng)，減少活性）或者單純地浪費(fèi)昂貴的試劑。

緩沖液的選擇和具體方案（配體和反應(yīng)基團(tuán)）有關(guān)。在選擇緩沖液時(shí)，考慮到與配體的相容性。此外，還要考慮到緩沖液中不能包含參與或干擾反應(yīng)的化合物。比如，磷酸鹽和醋酸鹽緩沖液會(huì)降低碳二亞胺的反應(yīng)活性，因此不建議在羧基微球偶聯(lián)中作為活躍緩沖液使用。在這種情況下，一種流行的替代是使用MES。又如，在與胺活性化學(xué)物質(zhì)作用時(shí)，應(yīng)避免含有游離胺的緩沖液（Tris或甘氨酸）。

a、磷酸鹽緩沖液（PBS）pH 7.4

i. 磷酸氫二鉀: 1.82 g/L (MW 174.2)
ii. 磷酸二氫鈉: 0.22 g/L (MW 120.0)
iii. 氯化鈉: 8.76 g/L (MW 58.4)

用去離子水并定容至1L，用1N鹽酸或1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.4.

b、硼酸鹽緩沖液 pH8.5

i. 硼酸, H3BO3: 12.4 g/L (MW 61.8)
ii. 硼氫化鈉: 19.1 g/L (MW 381.4)

加入50mL硼酸溶液至14.5mL硼氫化鈉溶液中,用去離子水并定容至200mL。用3M的氫氧化鈉 調(diào)節(jié)pH至8.5.

c、醋酸鹽緩沖液 pH3.6~5.6

i. 0.1 M 醋酸: (5.8mL制備1000mL)
ii. 0.1 M 醋酸鈉: 8.2 g/L (無(wú)水, MW 82.0)

按如下所示比例混合醋酸和醋酸鈉溶液，用去離子水并定容至100mL。用1N鹽酸或 1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。

d、檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液 pH2.6~7.0

i. 0.1 M 檸檬酸: 19.2 g/L (MW 192.1)
ii. 0.2 M 磷酸氫二鈉: 35.6 g/L (二水, MW 178.0)

按如下所示比例混合檸檬酸和磷酸氫二鈉溶液，用去離子水并定容至100mL。用1N 鹽酸或1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。

e、碳酸鹽-碳酸氫鈉緩沖液 pH9.2-10.4

i. 0.1 M 碳酸鈉: 10.6 g/L (無(wú)水, MW 106.0)
ii. 0.1 M 碳酸氫鈉: 8.4 g/L (MW 84.0)

按如下所示比例混合碳酸鈉和碳酸氫鈉溶液，用去離子水并定容至200mL。用1N 鹽酸或1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。

f、MES緩沖液 pH5.7~7.2

溶解21.3gMES一水物至約900mL的純水中。用1N鹽酸或1N氫氧化鈉滴定至所需的pH并用純水定容至1000mL。

*膠乳溶液一般常用低濃度的Good's緩沖液儲(chǔ)存。

低濃度(0.05%-0.1%)的抗菌劑,例如疊氮鈉或硫柳汞，經(jīng)常被加入到儲(chǔ)存緩沖液中，特別是長(zhǎng)期儲(chǔ)存的時(shí)候。抗菌劑的選擇要謹(jǐn)慎，因?yàn)樗麄兛赡軙?huì)展現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性，涉及到特殊處理事項(xiàng)等。例如，疊氮鈉與鉛、銅管道反應(yīng)會(huì)生成易爆的疊氮金屬化合物，因此，在清理材料時(shí)，要用大量的水沖洗管道并防止疊氮化物積累。

阻斷劑通常在偶聯(lián)反應(yīng)后用于包被微球，可以使微球與非目標(biāo)分子的非特異性結(jié)合變小。阻斷劑應(yīng)謹(jǐn)慎選擇，以確保它可以有效地減少非特異性相互作用。某些阻斷劑可能會(huì)干擾檢測(cè)，或?qū)嶋H上有助于非特異性結(jié)合。對(duì)阻斷劑的濃度進(jìn)行評(píng)估，確保有足夠的阻擋而沒有顯著的活性損失。阻斷劑通常以不同的量加入到儲(chǔ)存緩沖液中，標(biāo)準(zhǔn)濃度為0.05~0.1%中的任意值。在一個(gè)獨(dú)立的孵育中，為了飽和微球的暴露表面，建議在儲(chǔ)存前用更高濃度的阻斷劑（1%）。以下是一些常用的阻斷劑：

a. BSA(牛血清白蛋白）：經(jīng)常單獨(dú)使用，但是可以和其他的阻斷劑復(fù)合使用，常用的表面活性劑。

b. 酪蛋白：一種牛奶基質(zhì)的蛋白質(zhì)，含有生物素原，在工作系統(tǒng)涉及生物素時(shí)應(yīng)避免使用以防止干擾。

c. Pepticase（酪蛋白酶解產(chǎn)物）：酪蛋白的酶促衍生物，當(dāng)工作系統(tǒng)涉及生物素時(shí)同樣應(yīng)該避免。

d. 非離子表面活性劑：吐溫20和Triton(R)X-100是典型的。當(dāng)與另一種阻斷劑使用時(shí)，一個(gè)常用的比例為1％阻滯劑; 0.05％的表面活性劑。

e. 不相關(guān)的“IgG”：經(jīng)常在標(biāo)記特性IgG到微球上時(shí)使用。例如：如果偶聯(lián)小鼠IgG，兔（或任一非交聯(lián)反應(yīng)的IgG）可以用作阻斷劑被吸附。

f. FSG（魚皮明膠）：純明膠或明膠水解產(chǎn)物也可使用。

g. PEG（聚乙二醇）：一個(gè)多功能的阻斷劑，可提供不同的分子量、結(jié)構(gòu)和負(fù)載。

h. 血清：非交聯(lián)反應(yīng)血清，如馬血清或魚血清，在與各類抗體的交聯(lián)反應(yīng)中都有很強(qiáng)的惰性。

i. 商業(yè)阻滯劑：許多公司提供制劑，其是各種分子量的兩種或更多種單阻斷物質(zhì)的復(fù)合，并且其可以有效地在寬范圍的條件下使用。這些以不同的商品名稱出售，而大多數(shù)化學(xué)廠商將提供多種。

阻斷劑的品種還有許多，我們建議嘗試各種組合和濃度。

微球的處理對(duì)偶聯(lián)過程的結(jié)果有著顯著的影響。研究人員應(yīng)該先考慮微球的清洗過程，這會(huì)影響偶聯(lián)的效率，微球的損失等。在過程控制中應(yīng)當(dāng)對(duì)其的單分散性進(jìn)行監(jiān)控，如果觀察到凝集則需要處理。

還有其他參數(shù)可以被評(píng)估，包括培養(yǎng)時(shí)間和溫度，試劑添加的順序和速度等。

【問題】：如何選擇微球粒徑？
【回答】：一般選擇粒徑小的膠乳微球，則需要的抗體量就多，精密度和線性相對(duì)較好，而選擇粒徑大的膠乳微球性，則所需抗體少，精密度和線性相對(duì)較差，相對(duì)于小球，大球的靈敏度較好。

【問題】：膠乳的自凝現(xiàn)象如何控制和避免？
【回答】：膠乳自凝與許多因素有關(guān)，如高電解質(zhì)濃度、表面價(jià)電荷被中和、或置于某些不利環(huán)境如冷凍時(shí)。如果電解質(zhì)濃度升高到某一水平，使得表面的價(jià)負(fù)荷被掩蔽，膠乳微球之間發(fā)生接觸，于是便產(chǎn)生凝集，故高離子強(qiáng)度的緩沖溶液不應(yīng)使用，緩沖溶液的的濃度不要超過 50mM，但有些 CML 膠乳微球具有高電荷密度，則也能夠耐受較高的離子強(qiáng)度。對(duì)負(fù)電荷膠乳微球，不能使用陽(yáng)電荷的緩沖溶液如 Tris 緩沖溶液，因?yàn)槟苁闺姾芍泻投?。在長(zhǎng)期貯藏時(shí)，懸浮介質(zhì)的pH值應(yīng)至少保持在比膠乳微球表面基團(tuán)的 pKa 值高1-2pH單位。高濃度的膠乳微球容易促使膠體不穩(wěn)定，故膠乳微球的濃度盡量以低濃度為宜，膠乳微球也不能受冷凍，否則會(huì)凝集。

【問題】：微球與抗體偶聯(lián)應(yīng)選用一步法還是二步法？
【回答】：一步法是將微球、抗體、偶聯(lián)劑一起加入到體系中進(jìn)行反應(yīng)，更適用于小分子的偶聯(lián)，比如：類固醇、半抗原。

【問題】：微球與抗體偶聯(lián)后，當(dāng)時(shí)沒發(fā)現(xiàn)有凝集，但隔夜后發(fā)現(xiàn)有凝集，這是什么原因？ 如何控制和避免？
【回答】：這種情況一般是偶聯(lián)效率低的原因。當(dāng)體系中蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交聯(lián)后還空出許多反應(yīng)基團(tuán)時(shí)，這些基團(tuán)又可以與相連微球上的蛋白反應(yīng)，結(jié)果是把球又拉在一起了，所以有聚集?？梢约右恍┳钄鄤┙鉀Q。

【問題】：膠乳溶液用什么緩沖液多大離子強(qiáng)度保存穩(wěn)定性更好？
【回答】：一般常用的是低濃度的 Goods 緩沖液，如MOPSO、MES、HEPES 等緩沖液，濃度在25-50mmol/L。